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赛默飞Veriti96梯度PCR仪做实验时的影响因素有?
  • 发布日期:2020-07-24      浏览次数:114
    •    赛默飞Veriti96梯度PCR仪做实验时的影响因素有?
        赛默飞Veriti96梯度PCR仪采用了成熟的帕尔贴技术准确控制升降温度,多重温度探针检测系统,确保每台仪器稳定可靠运行。每一个加热孔都经过准确计算,升温更快,温控更准确,保证实验稳定进行。
        本产品能够满足实验室的需求和研究者的实验要求,出色地完成普通PCR、梯度PCR、长片段扩增、恒温酶切和连接等实验等试验;同时它还采用简单的操作面板,很好的精度和稳定性保障结果再现,升降温速率快,Z高可达3度/秒,12步梯度选择。
        使用赛默飞Veriti96梯度PCR仪做实验时有哪些影响因素?
        1、酶及其浓度
        目前有两种TaqDNA聚合酶供应,一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。
        2、dNTP的质量与浓度
        dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1MNaOH或1MTris.HCL的缓冲液将其PH调节到7.0~7.5,小量分装,-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为50~200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。
        3、温度与时间的设置
        基于赛默飞Veriti96梯度PCR仪原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90~95℃变性,再迅速冷却至40~60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70~75℃,在TaqDNA聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100~300bp时)可采用二温度点法,除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度TaqDNA酶仍有较高的催化活性)。
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